ಸುದ್ದಿ

IPTG (ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್-β-D-ಥಿಯೊಗಲಾಕ್ಟೊಸೈಡ್) β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೊಸಿಡೇಸ್ ತಲಾಧಾರದ ಒಂದು ಅನಲಾಗ್ ಆಗಿದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ.IPTG ಯ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ, ಪ್ರಚೋದಕವು ದಮನಕಾರಿ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದು, ಆದ್ದರಿಂದ ರೆಪ್ರೆಸರ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ರಚನೆಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಅದನ್ನು ಗುರಿ ಜೀನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಗುರಿ ಜೀನ್ ಅನ್ನು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹಾಗಾದರೆ ಪ್ರಯೋಗದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ IPTG ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸಬೇಕು?ದೊಡ್ಡದು ಉತ್ತಮವೇ?
ಮೊದಲಿಗೆ, IPTG ಇಂಡಕ್ಷನ್ ತತ್ವವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳೋಣ: E. ಕೋಲಿಯ ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಒಪೆರಾನ್ (ಅಂಶ) ಮೂರು ರಚನಾತ್ಮಕ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ, Z,Y ಮತ್ತು A, ಇದು ಕ್ರಮವಾಗಿ β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸಿಡೇಸ್, ಪರ್ಮೀಸ್ ಮತ್ತು ಅಸಿಟೈಲ್ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರೇಸ್ ಅನ್ನು ಎನ್ಕೋಡ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಲ್ಯಾಕ್ಝಡ್ ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಅನ್ನು ಗ್ಲೂಕೋಸ್ ಮತ್ತು ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸ್ ಆಗಿ ಅಥವಾ ಅಲೋ-ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಆಗಿ ಹೈಡ್ರೊಲೈಸ್ ಮಾಡುತ್ತದೆ;ಲ್ಯಾಸಿವೈ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿರುವ ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಜೀವಕೋಶದ ಪೊರೆಯ ಮೂಲಕ ಹಾದುಹೋಗಲು ಮತ್ತು ಜೀವಕೋಶವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ;lacA ಅಸಿಟೈಲ್ ಗುಂಪನ್ನು ಅಸಿಟೈಲ್-CoA ನಿಂದ β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೊಸೈಡ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ವಿಷಕಾರಿ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ, ಆಪರೇಟಿಂಗ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ O, ಆರಂಭಿಕ ಅನುಕ್ರಮ P ಮತ್ತು ನಿಯಂತ್ರಕ ಜೀನ್ I. I ಜೀನ್ ಕೋಡ್ ರೆಪ್ರೆಸರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಆಗಿದ್ದು ಅದು ಆಪರೇಟರ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ನ O ಸ್ಥಾನಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ನಿಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆರಿಸಿದೆ.ಕ್ಯಾಟಬಾಲಿಕ್ ಜೀನ್ ಆಕ್ಟಿವೇಟರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್-ಸಿಎಪಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಆರಂಭದ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ನ ಅಪ್‌ಸ್ಟ್ರೀಮ್‌ಗೆ ಒಂದು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್ ಕೂಡ ಇದೆ.ಜೀನ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಸಂಘಟಿತ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಲು ಮೂರು ಕಿಣ್ವಗಳ ಕೋಡಿಂಗ್ ಜೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ನಿಯಂತ್ರಕ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ, ಲ್ಯಾಕ್ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ನಿಗ್ರಹ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿದೆ.ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, PI ಪ್ರವರ್ತಕ ಅನುಕ್ರಮದ ನಿಯಂತ್ರಣದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ I ಅನುಕ್ರಮದಿಂದ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾದ ಲ್ಯಾಕ್ ರೆಪ್ರೆಸರ್ O ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು RNA ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ಅನ್ನು P ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಲೇಖನ ಪ್ರಾರಂಭವನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ;ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಇದ್ದಾಗ, ಲ್ಯಾಕ್ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಬಹುದು ಈ ಒಪೆರಾನ್ (ಮೆಟಾ) ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ, ನಿಜವಾದ ಪ್ರಚೋದಕವು ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಅಲ್ಲ.ಲ್ಯಾಕ್ಟೋಸ್ ಜೀವಕೋಶವನ್ನು ಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಲೋಲಕ್ಟೋಸ್ ಆಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲು β-ಗ್ಯಾಲಕ್ಟೋಸಿಡೇಸ್‌ನಿಂದ ವೇಗವರ್ಧನೆಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ಎರಡನೆಯದು, ಪ್ರಚೋದಕ ಅಣುವಾಗಿ, ದಮನಕಾರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್ ವಿನ್ಯಾಸವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು O ಅನುಕ್ರಮ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿಲೇಖನದಿಂದ ನಿಗ್ರಹಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ವಿಘಟನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್ಥಿಯೊಗಲಾಕ್ಟೊಸೈಡ್ (IPTG) ಅಲೋಲಾಕ್ಟೋಸ್ನಂತೆಯೇ ಅದೇ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಇದು ಅತ್ಯಂತ ಶಕ್ತಿಯುತವಾದ ಪ್ರಚೋದಕವಾಗಿದೆ, ಇದು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದಿಂದ ಚಯಾಪಚಯಗೊಳ್ಳುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ತುಂಬಾ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಇದನ್ನು ಪ್ರಯೋಗಾಲಯಗಳಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

IPTG ಯ ಅತ್ಯುತ್ತಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು?E. coli ಅನ್ನು ಉದಾಹರಣೆಯಾಗಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಿ.
ಧನಾತ್ಮಕ ಮರುಸಂಯೋಜಕ pGEX (CGRP/msCT) ಹೊಂದಿರುವ E. coli BL21 ತಳೀಯವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಸ್ಟ್ರೈನ್ ಅನ್ನು 50μg·mL-1 Amp ಹೊಂದಿರುವ LB ದ್ರವ ಮಾಧ್ಯಮಕ್ಕೆ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 37 ° C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು.ಮೇಲಿನ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು 50mL ತಾಜಾ LB ದ್ರವ ಮಾಧ್ಯಮದ 10 ಬಾಟಲಿಗಳಲ್ಲಿ 50μg·mL-1 Amp ಅನ್ನು ವಿಸ್ತರಣಾ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಾಗಿ 1:100 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಚುಚ್ಚಲಾಯಿತು ಮತ್ತು OD600 ಮೌಲ್ಯವು 0.6~0.8 ಆಗಿದ್ದಾಗ, IPTG ಅನ್ನು ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಇದು 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ಆಗಿದೆ.ಅದೇ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ, ಅದರಿಂದ 1 ಮಿಲಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಮೇಲೆ ವಿವಿಧ IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಗಳ ಪ್ರಭಾವವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು SDS-PAGE ಗೆ ಒಳಪಡಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ನಂತರ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.
ಪ್ರಯೋಗಗಳ ನಂತರ, IPTG ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಸಾಧ್ಯವಾದಷ್ಟು ದೊಡ್ಡದಲ್ಲ ಎಂದು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗುತ್ತದೆ.ಏಕೆಂದರೆ ಐಪಿಟಿಜಿ ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾಕ್ಕೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿಷತ್ವವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ.ಏಕಾಗ್ರತೆಯನ್ನು ಮೀರಿದರೆ ಜೀವಕೋಶವೂ ಸಾಯುತ್ತದೆ;ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಜೀವಕೋಶದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಕರಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ವ್ಯಕ್ತವಾಗುತ್ತದೆ, ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಭಾವಿಸುತ್ತೇವೆ, ಆದರೆ ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ IPTG ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾದಾಗ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ಸೇರ್ಪಡೆ ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.ದೇಹ, ಆದರೆ ಕರಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರಮಾಣ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಅತ್ಯಂತ ಸೂಕ್ತವಾದ IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ದೊಡ್ಡದಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಉತ್ತಮವಾಗಿರುತ್ತದೆ.
ತಳೀಯವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ತಳಿಗಳ ಇಂಡಕ್ಷನ್ ಮತ್ತು ಕೃಷಿಯ ಉದ್ದೇಶವು ಗುರಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದು ಮತ್ತು ವೆಚ್ಚವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದು.ಗುರಿ ಜೀನ್‌ನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯು ಸ್ಟ್ರೈನ್‌ನ ಸ್ವಂತ ಅಂಶಗಳು ಮತ್ತು ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ನಿಂದ ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, ಪ್ರಚೋದಕದ ಸಾಂದ್ರತೆ, ಇಂಡಕ್ಷನ್ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಇಂಡಕ್ಷನ್ ಸಮಯದಂತಹ ಇತರ ಬಾಹ್ಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಂದಲೂ ಪ್ರಭಾವಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಆದ್ದರಿಂದ, ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ, ಅಜ್ಞಾತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಿಸುವ ಮೊದಲು, ಸೂಕ್ತವಾದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಇಂಡಕ್ಷನ್ ಸಮಯ, ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು IPTG ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುವುದು ಉತ್ತಮ.